TINCION DE GRAM

TINCION DE GRAM

La Tincion de Gram es una técnica de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las bacterias.

La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen (esputo, orina, pus, etcétera) que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido. En el primer caso permanecería el color morado, y se trataría de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendría un color rosado, y serían Gram negativas.

Gram  Positivas.

Gram Negativas.

El primer paso para realizar este proceso es realizar el frotis.

a) Se toma una pequeña muestra con el asa de platino.

b) Se fija el frotis flameando suavemente el portaobjeto por la llama del mechero.

c) Se cubre el frotis con un colorante.

d)Lavar el frotis con agua destilada o corriente.

e) Se seca suavemente con un papel absorbente.

f) Se observa al microscopio, enfocando en primer lugar con el objetivo del menor aumento y luego con el de mayor aumento, utilizando aceite de inmercion.

g) Dibujar lo observado y registrar la forma de la célula y el tipo de agrupación que esta presente.

Pasos para realizar la tincion de gram

I. Primero se cubre el frotis con 2 gotas de cristal violeta de 30 segundos a 1 minuto.

II. Después se lava el frotis con agua, en forma cuidadosa, para eliminar el exceso de colorante.

III. Se cubre el preparado con 2 gotas de lugol, durante 30 segundos.

IV. Se lava cuidadosamente el frotis con agua.

V. Después se cubre el frotis con alcohol al 95% durante un minuto  (procurando inclinar el portaobjeto y aplicar gota a gota, dejando que escurra hasta que no fluya mas la tinta).

VI. Luego se lava el frotis con agua inmediatamente.

VII. Se cubre el frotis con safranina aproximadamente 2 gotas durante 30 segundos.

VIII. Hay que lavar nuevamente con agua, eliminando cuidadosamente el exceso de agua.

IX. Secar suavemente con toalla,absorbente y dejar secar al aire.

X. Observar el frotis al microscopio, enfocando con el objetivo de bajo aumento, hasta llegar al de inmercion.

XI. Dibujar y registrar las observaciones realizadas en el frotis, como el tipo de coloración, forma y agrupación celular.

PREPARACIÓN DE UN ANTIBIOGRAMA.

¿Que es un antibiograma?

Es la prueba microbiologica que se realiza para determinar la susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de antibioticos. Las tecnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiologia para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismo responsables de las infecciones..

¿Que es un antibiotico?

Es una sustancia química producida por un ser vivo o derivado sintético, que mata o impide el crecimiento de ciertas clases de microorganismos sensibles, generalmente bacterias. Los antibióticos se utilizan en medicina humana, animal y horticultura para tratar infecciones provocadas por gérmenes. 

¿Que es hipersensibilidad?

La hipersensibilidad es una sensibilidad excesiva o una respuesta exagerada a la reacción Ag-Ac. En estos casos la respuesta inmune tiene efectos nocivos, puede originar daños más o menos graves. Esta reacción también se conoce como alergia

Hay dos tipos de hipersensibilidad:

Hipersensibilidad inmediata: es la reacción alérgica que se presenta a los pocos minutos de la inyección del antígeno. Ejemplo: las ortigas.

Hipersensibilidad retardada: aparece pasado un tiempo, horas o días después del ataque del antígeno. Ejemplo: rechazo a un órgano transplantado.  

Medicamentos de amplio espectro: Son medicamentos que poseen la característica de eliminar ademas de bacterias, organismos que se conocen como atípicos (Ricketsias, micoplasmas y chlamydias ).                  

8 de Octubre del 2014

8 de Octubre del 2014

TSI (Triple Azúcar Hierro)

El agar TSI es un medio diferencial que determina tanto la fermentación de los hidratos de carbono como la producción de ácido sulfihidrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, características que son utilizadas para la diferenciación de estas, principalmente para las enterobacterias.

Este medio contiene lactosa en una concentración  de 1% y glucosa 0.1%, lo cual permite la observación de la fermentación de uno o de ambos carbohidratos por parte de las bacterias, ademas de la producción de gas y de ácido sulfhidrico. La fermentacion es un proceso que se lleva acabo en condiciones aerobicas (pico de flauta) y anaerobica (fondo). En el pico de flauta la glucosa (monosacarido) es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaerobico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar ácido pirúvico y posteriormente este sera degradado a traves del ciclo de Krebs para dar  CO₂, H₂O  y energia.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables, el tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhidrico, el sulfato de hierro y amonio es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhidrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Extracto de carne	3.0	Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.
Pluripeptona	20.0
Cloruro de sodio	5.0
Lactosa	10.0
Sacarosa	10.0
Glucosa	1.0
Sulfato de hierro y amonio	0.2
Tiosulfato de sodio	0.2
Rojo de fenol	0.025
Agar	13.0
pH final: 7.3 ± 0.2

SIEMBRA

El medio se sirve en tubo de ensaye, y se realiza estrías por agotamiento,su incubacion se realiza  de 35-37ºC durante 24 hrs en aerobiosis.

RESULTADOS

1. Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.

2. Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.

3. Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azucares.

4. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.

5. El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhidrico.

A: Reacción ácido (color amarillo).

K: Reacción alcalina ( color rojo-naranja).

A/A: Fermentación de los tres azucares (glucosa, lactosa y sacarosa).

K/A: Fermentación de la glucosa. 

K/K: No hay fermentación de la glucosa, lactosa ni sacarosa.

Precipitado negro: Formación de ácido sulfihidrico.

Burbujas: `Presencia de gas.

8 de Octubre del 2014

8 de Octubre del 2014

Urea

En el medio de cultivo, la tripteina y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberan
do amoniaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Tripteína	1.0	Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 2 minutos. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C y agregar 50 ml de una solución de urea al 40% previamente esterilizada por filtración o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemólisis y solidificar en pico de flauta con fondo profundo.
Glucosa	1.0
Cloruro de sodio	5.0
Fosfato monopotásico	2.0
Rojo de fenol	0.012
Agar	15.0
pH final: 6.8 ± 0.2

REACCIÓN QUÍMICA:

Se utiliza solamente para la detección de la actividad de la ureasa en especies del genero proteus que dan la prueba positiva después de una incubación de 8h. Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes de que la bacteria muestre un crecimiento aceptable no podrá determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar la urea. Si un microorganismo es capaz de hidrolizar la urea, pero no de utilizar amoniaco como fuente de nitrógeno, no se produce crecimiento y es posible observar un resultado falso negativo. No se recomienda para las bacterias con reacción de ureasa retardada. Sembrar el medio de cultivo con el cultivo puro de ensayo. Incubar 24 - 48 h a  35ºC, en ocasiones hasta 72 horas.

ALGUNAS BACTERIAS

Microorganismo	Actividad ureásica	Color del medio
Proteus mirabilis ATCC 43071	Positiva	Rojo-Rosado
K. pneumoniae ATCC 700603	Positiva débil	Rojo-Rosado
Escherichia coli ATCC 25922	Negativa	Amarillo
S. flexneri ATCC 12022	Negativa	Amarillo
S. typhimurium ATCC 14028	Negativa	Amarillo